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ROS活性氧检测试剂盒
  • 品牌:XKBio
  • 产地:上海
  • 型号:1000T
  • 货号:XK6033
  • 价格: ¥395/支
  • 发布日期: 2022-03-26
  • 更新日期: 2024-11-08
产品详请
产地 上海
品牌 XKBio
货号 XK6033
用途 科研
包装规格 1000T
纯度 100%
CAS编号
是否进口

ROS 活性氧检测试剂盒 产品说明书
ROS 活性氧检测试剂盒
产品货号:XK6033
产品规格:1000T
产品内容:
组分 规格
A. DCFH-DA(10 mM) 0.1 mL
B. 活性氧阳性对照(Rosup 100 mM) 1 mL
产品参数
Ex/Em:504/529 nm
储存条件
-20℃避光保存,有效期见外包装。
产品介绍
DCFH-DA (二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯) 本身无荧光,
可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的酯酶水解,
形成 DCFH,DCFH 无荧光且不能通透细胞膜,从而被细胞
内的活性氧氧化生成有荧光的 DCF。根据活细胞中荧光的
产生,可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或
荧光显微镜可直接观察, 是一种经典的组织或活细胞中活性
氧检测方法。Rosup为活性氧阳性诱导药物,根据其荧光信
号强度,可分析活性氧的真正水平。


使用方法
1. 装载ROS探针
(1)原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
a. 细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞
数量小于5×105
/mL。
b. 药物诱导:去除细胞培养液,加入无血清培养基稀释的
药物处理,于37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间由
药物特性和细胞类型决定。
c. (可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照
(Rosup, 100 mM) 到常用工作浓度100 μM, 加入细胞, 37℃
避光孵育30 min-4 h,以提高活性氧水平,不同细胞类型存
在差异。例如:HeLa细胞需孵育30-60 min,MRC5人胚胎成
纤维细胞则需孵育90 min。
d. ROS探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀
释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
e. ROS探针装载:吸除处理药物,加入适当体积稀释好的
DCFH-DA工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如:6
孔板通常不少于1 mL,对于96孔板通常不少于100 μL。37℃
细胞培养箱内避光孵育30 min。
f. 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1-2次,以充分去除
未进入细胞内的DCFH-DA。
(2)收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
a. 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细
胞状态。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
b. 药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,
于37℃细胞培养箱内避光孵育, 实际诱导时间由药物特性和
细胞类型决定。
c. (可选)阳性对照:先用无血清培养基稀释阳性对照
(Rosup, 100 mM) 到常用工作浓度100 μM, 加入细胞, 37℃
避光孵育30 min-4 h以提高活性氧水平,不同细胞类型存在
差异。例如:HeLa细胞需孵育30-60 min,MRC5人胚胎成纤
维细胞则需孵育90 min。
d. ROS探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液
稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
e. 探针装载:除去细胞内药物,离心收集细胞,加入稀释
好的探针,使其细胞密度为1.0×106
-2.0×107。
注意:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检
测总量来进行调整。例如:对于流式分析,单管检测内细胞
数目不少于104
,也不可多于106

f. 细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次,以充分
去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2. 荧光显微镜检测
(1)对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观
察;对悬浮生长细胞,取 25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微
载玻片上,再盖上一张盖玻片。
(2)荧光显微镜下,选用 FITC 滤光片观察荧光,去除背
景观察荧光的变化。
3. 流式细胞仪分析
(1)对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对
悬浮生长细胞,直接收集细胞。用 0.5-1 mL PBS 重悬细胞
(0.5-1×105
/mL)。
(2)选择流式细胞仪 FL1 或 BL1 通道,488 nm 激发,测
定 530 nm的发射,细胞应可分成两个亚群:ROS阴性细胞
仅有很低的荧光强度,ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
注意事项
1. 阳性对照 Rosup 一般使用浓度为 100 μM(推荐浓度
100-400 μM,具体依细胞类型而定)。通常刺激后 30 min-4
h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活
性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30
min 内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高
活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱
导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
2. 实验过程中,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也
比较强,可以按照 1:2000-1:5000 稀释 DCFH-DA,使
DCFH-DA 的终浓度为 2-5 μM。 探针装载的时间也可以根据
情况在 15-60 min 内适当进行调整。
3. 活性氧阳性对照 (Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品,
并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
4. 探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,
否则会导致背景较高。
本产品仅用于科研

ROS 活性氧检测试剂盒

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