上海晅科生物科技有限公司
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      产品分类
    ROS活性氧检测试剂盒
    物品单位 价格 品牌
    395 XKBio
    • 产地:上海
    • 型号:1000T
    • 货号:XK6033
    • 发布日期: 2022-03-26
    • 更新日期: 2022-03-26
    产品详细说明
    产地 上海
    品牌 XKBio
    货号 XK6033
    用途范围 科研
    纯度 100%
    CAS编号
    规格 1000T
    是否进口

    ROS 活性氧检测试剂盒 产品说明书
    ROS 活性氧检测试剂盒
    产品货号:XK6033
    产品规格:1000T
    产品内容:
    组分 规格
    A. DCFH-DA(10 mM) 0.1 mL
    B. 活性氧阳性对照(Rosup 100 mM) 1 mL
    产品参数
    Ex/Em:504/529 nm
    储存条件
    -20℃避光保存,有效期见外包装。
    产品介绍
    DCFH-DA (二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯) 本身无荧光,
    可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的酯酶水解,
    形成 DCFH,DCFH 无荧光且不能通透细胞膜,从而被细胞
    内的活性氧氧化生成有荧光的 DCF。根据活细胞中荧光的
    产生,可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或
    荧光显微镜可直接观察, 是一种经典的组织或活细胞中活性
    氧检测方法。Rosup为活性氧阳性诱导药物,根据其荧光信
    号强度,可分析活性氧的真正水平。


    使用方法
    1. 装载ROS探针
    (1)原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
    a. 细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞
    数量小于5×105
    /mL。
    b. 药物诱导:去除细胞培养液,加入无血清培养基稀释的
    药物处理,于37℃细胞培养箱内避光孵育,实际诱导时间由
    药物特性和细胞类型决定。
    c. (可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照
    (Rosup, 100 mM) 到常用工作浓度100 μM, 加入细胞, 37℃
    避光孵育30 min-4 h,以提高活性氧水平,不同细胞类型存
    在差异。例如:HeLa细胞需孵育30-60 min,MRC5人胚胎成
    纤维细胞则需孵育90 min。
    d. ROS探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀
    释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
    e. ROS探针装载:吸除处理药物,加入适当体积稀释好的
    DCFH-DA工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如:6
    孔板通常不少于1 mL,对于96孔板通常不少于100 μL。37℃
    细胞培养箱内避光孵育30 min。
    f. 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1-2次,以充分去除
    未进入细胞内的DCFH-DA。
    (2)收集细胞后装载探针(适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
    a. 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细
    胞状态。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
    b. 药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,
    于37℃细胞培养箱内避光孵育, 实际诱导时间由药物特性和
    细胞类型决定。
    c. (可选)阳性对照:先用无血清培养基稀释阳性对照
    (Rosup, 100 mM) 到常用工作浓度100 μM, 加入细胞, 37℃
    避光孵育30 min-4 h以提高活性氧水平,不同细胞类型存在
    差异。例如:HeLa细胞需孵育30-60 min,MRC5人胚胎成纤
    维细胞则需孵育90 min。
    d. ROS探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液
    稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μM。
    e. 探针装载:除去细胞内药物,离心收集细胞,加入稀释
    好的探针,使其细胞密度为1.0×106
    -2.0×107。
    注意:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检
    测总量来进行调整。例如:对于流式分析,单管检测内细胞
    数目不少于104
    ,也不可多于106

    f. 细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次,以充分
    去除未进入细胞内的DCFH-DA。
    2. 荧光显微镜检测
    (1)对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观
    察;对悬浮生长细胞,取 25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微
    载玻片上,再盖上一张盖玻片。
    (2)荧光显微镜下,选用 FITC 滤光片观察荧光,去除背
    景观察荧光的变化。
    3. 流式细胞仪分析
    (1)对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对
    悬浮生长细胞,直接收集细胞。用 0.5-1 mL PBS 重悬细胞
    (0.5-1×105
    /mL)。
    (2)选择流式细胞仪 FL1 或 BL1 通道,488 nm 激发,测
    定 530 nm的发射,细胞应可分成两个亚群:ROS阴性细胞
    仅有很低的荧光强度,ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
    注意事项
    1. 阳性对照 Rosup 一般使用浓度为 100 μM(推荐浓度
    100-400 μM,具体依细胞类型而定)。通常刺激后 30 min-4
    h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活
    性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30
    min 内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高
    活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱
    导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
    2. 实验过程中,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也
    比较强,可以按照 1:2000-1:5000 稀释 DCFH-DA,使
    DCFH-DA 的终浓度为 2-5 μM。 探针装载的时间也可以根据
    情况在 15-60 min 内适当进行调整。
    3. 活性氧阳性对照 (Rosup) 仅仅用于作为阳性对照的样品,
    并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
    4. 探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,
    否则会导致背景较高。
    本产品仅用于科研

    ROS 活性氧检测试剂盒