ROS 活性氧检测试剂盒 产品说明书
ROS 活性氧检测试剂盒
产品货号：XK6033
产品规格：1000T
产品内容：
组分 规格
A. DCFH-DA（10 mM） 0.1 mL
B. 活性氧阳性对照（Rosup 100 mM） 1 mL
产品参数
Ex/Em：504/529 nm
储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。
产品介绍
DCFH-DA （二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯） 本身无荧光，
可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的酯酶水解，
形成 DCFH，DCFH 无荧光且不能通透细胞膜，从而被细胞
内的活性氧氧化生成有荧光的 DCF。根据活细胞中荧光的
产生，可以判断细胞活性氧的含量和变化。用流式细胞仪或
荧光显微镜可直接观察， 是一种经典的组织或活细胞中活性
氧检测方法。Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信
号强度，可分析活性氧的真正水平。

使用方法
1. 装载ROS探针
（1）原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
a. 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞
数量小于5×105
/mL。
b. 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的
药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由
药物特性和细胞类型决定。
c. （可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照
（Rosup, 100 mM） 到常用工作浓度100 μM， 加入细胞， 37℃
避光孵育30 min-4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存
在差异。例如：HeLa细胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成
纤维细胞则需孵育90 min。
d. ROS探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀
释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
e. ROS探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的
DCFH-DA工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6
孔板通常不少于1 mL，对于96孔板通常不少于100 μL。37℃
细胞培养箱内避光孵育30 min。
f. 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除
未进入细胞内的DCFH-DA。
（2）收集细胞后装载探针（适用于贴壁细胞和悬浮细胞）
a. 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细
胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
b. 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，
于37℃细胞培养箱内避光孵育， 实际诱导时间由药物特性和
细胞类型决定。
c. （可选）阳性对照：先用无血清培养基稀释阳性对照
（Rosup, 100 mM） 到常用工作浓度100 μM， 加入细胞， 37℃
避光孵育30 min-4 h以提高活性氧水平，不同细胞类型存在
差异。例如：HeLa细胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成纤
维细胞则需孵育90 min。
d. ROS探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液
稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
e. 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释
好的探针，使其细胞密度为1.0×106
-2.0×107。
注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检
测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞
数目不少于104
，也不可多于106
。
f. 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次，以充分
去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2. 荧光显微镜检测
（1）对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观
察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微
载玻片上，再盖上一张盖玻片。
（2）荧光显微镜下，选用 FITC 滤光片观察荧光，去除背
景观察荧光的变化。
3. 流式细胞仪分析
（1）对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对
悬浮生长细胞，直接收集细胞。用 0.5-1 mL PBS 重悬细胞
(0.5-1×105
/mL)。
（2）选择流式细胞仪 FL1 或 BL1 通道，488 nm 激发，测
定 530 nm的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞
仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
注意事项
1. 阳性对照 Rosup 一般使用浓度为 100 μM（推荐浓度
100-400 μM，具体依细胞类型而定）。通常刺激后 30 min-4
h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活
性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30
min 内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高
活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可缩短诱
导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
2. 实验过程中，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也
比较强，可以按照 1:2000-1:5000 稀释 DCFH-DA，使
DCFH-DA 的终浓度为 2-5 μM。 探针装载的时间也可以根据
情况在 15-60 min 内适当进行调整。
3. 活性氧阳性对照 （Rosup） 仅仅用于作为阳性对照的样品，
并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
4. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，
否则会导致背景较高。
本产品仅用于科研

ROS 活性氧检测试剂盒