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      产品分类
    594-3-dUTP(594-3标记dUTP)
    物品单位 价格 品牌
    3160 XKBio
    • 产地:上海
    • 型号:25 nmole
    • 货号:XK0044
    • 发布日期: 2022-03-28
    • 更新日期: 2022-03-29
    产品详细说明
    产地 上海
    品牌 XKBio
    货号 XK0044
    用途范围 科研
    纯度 100%
    CAS编号
    规格 25 nmole
    是否进口

    594-3-dUTP(594-3标记dUTP)产品说明书
    594-3-dUTP(594-3标记dUTP)
    产品货号:XK0044
    产品规格:25 nmole
    储存条件
    -20℃避光保存,有效期见外包装。可以采用 pH7.4 的 10 mM
    Tris 溶解后,分装保存,避免反复冻融。

    使用方法
    DNA 标记
    1. 试剂(自备)
    (1)Taq DNA聚合酶
    (2)10× Taq reaction buffer
    (3)25 mM MgCl2
    (4)dATP, dTTP, dCTP, dGTP (单独溶液), 1 mM each
    (5)DNA模板
    (6)正向、反向引物,10 μM each
    (7)PCR 清洁试剂盒
    2. PCR反应
    (1)先按照表 1 反应体系配制PCR 反应混合液
    (2)再在每个反应管加 1μL 1mM YF® dye dUTP 染料
    注:阴性对照管,加 1 μL 1mM dTTP 代替 YF® dye dUTP
    (3)按照表 2 程序运行PCR反应
    注:a.  热变性时间依据不同的Taq 酶进行调整;
    b.  退火温度设置:Tm - 5℃;
    c.  延伸时间根据扩增片段大小而定,一般 200 - 300 bp
    片段设为 1 min 即可。
    (4) 可选步骤。用PCR 清洁试剂盒去除未掺入的单核苷酸。
    表 1 PCR 反应体系
    组分  体积  终浓度
    10× Taq reaction buffer  2 μL  1×
    25 mM MgCl2  2 μL  5 mM
    1 mM dATP  2 μL  100 μM
    1 mM dCTP  2 μL  100 μM
    1 mM dGTP  2 μL  100 μM
    1 mM dTTP  1 μL  50 μM
    10 μM  正向引物  1 μL  500 nM
    10 μM  反向引物  1 μL  500 nM
    模板  1 ng  50 pg/uL
    Taq  1 U  0.05 U/μL
    dH2O  up to 19 μL
    表 2 PCR 反应条件
    94℃ 2 min  Hold
    94℃ 30 sec
    30 个循环  50 - 60℃ 30 sec
    72℃ 1 min
    72℃ 5 min  Hold
    (5)取 10%的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶不加入
    DNA染料),检测 PCR 反应的效率和特异性,通过紫外凝
    胶成像仪或激光凝胶扫描仪观察。其中远红外染料(波长
    ≥650 nm),肉眼无法观察。
    注:凝胶染色前先观察 YF®染料的荧光,以免与下一步的凝
    胶染料发生荧光淬灭。
    (6)  采用后染法,使用 DNA 凝胶染料对凝胶进行染色,观
    察总的PCR 产物或阴性对照组的PCR 扩增产物。
    TUNEL 法检测细胞凋亡
    注:我司提供了一系列 YF®
    Dye TUNEL Assay Kits,试剂盒
    组分包括:平衡缓冲液、反应缓冲液和 TdT酶等。
    1. 试剂(自备)
    (1)PBS, pH 7.4
    (2)4%甲醛  in PBS
    (3)70%乙醇(可选)
    (4)0.2% Triton™ X - 100 in PBS
    (5)0.1% Triton™ X  - 100 in PBS/5 mg/mL bovine serum
    albumin (BSA)
    (6)12.5 U/μL末端脱氧核糖核苷酸转移酶  (TdT)
    (7)5×TdT反应缓冲液:1M 二甲基胂酸钾,125 mM Tris-
    HCl,1.25 mg/mL BSA,pH 6.6
    (8)25 mM CoCl2  溶液
    (9)100 μM dATP
    2. 样品准备
    (1)细胞或新鲜冷冻组织切片的准备
    a.  准备一份不含 TdT酶的样品作为阴性对照。(可选步骤)
    b.  用PBS 清洗细胞或者组织切片两次。
    c.  向上述细胞或组织切片中加入4%甲醛, 4℃孵育30 min。
    d. 用 70%乙醇重悬细胞,-20℃可储存两周。(可选步骤)
    e.  用PBS 清洗两次。
    f.  促渗加入适量的 0.2% Triton X - 100的PBS 溶液,室温孵
    育 30 min。
    g.  用PBS 清洗两次。
    (2)石蜡组织切片的准备
    a.  准备一份不含 TdT酶的样品做阴性对照(可选)。
    b.  根据标准步骤进行脱蜡或水化处理。
    c.  用PBS 清洗两次。
    d.  用20 μg/mL蛋白酶 K(in PBS)促渗,处理组织,37℃
    孵育 30 min。根据组织类型,蛋白酶 K 的孵育温度和时间
    可相应的变化。
    e.  用PBS 清洗两次。
    3. 反应混合液准备
    (1)用去离子水将 YF® dye dUTP 稀释成 10 μM。
    (2) 每个样品准备 100 μL TUNEL 平衡缓冲液,配比如下:
    20 μL 5×TdT反应缓冲液;
    20 μL 25 mM CoCl2;
    60 μL dH2O。
    (3)  每个样品准备50 μL TUNEL反应混合液,如下表所示:
    组分  体积  最终浓度
    5×TdT reaction buffer  10 μL  1×
    25 mM CoCl2  10 μL  5 mM
    100 μM dATP  2.5 μL  5 μM
    10 μM YF® dye dUTP  2.5 μL  0.5 μM
    12.5 U/μL TdT  1 μL  12.5 U/reaction
    dH2O  24 μL
    总体积  50 μL
    4. TUNEL 染色
    (1) 向样品中加入 100 μL平衡缓冲液,室温下孵育 5 min。
    注:对于贴壁细胞或者组织切片,用石蜡盖玻片覆盖样品,
    使缓冲液均匀覆盖样品。
    (2)去除平衡缓冲液,另外加入 50 μL反应缓冲液。
    注:对于贴壁细胞或者组织切片,用盖玻片覆盖样品,使缓
    冲液均匀覆盖组织。
    (3) 37℃避光孵育 60 min。组织切片需 37℃避光孵育 2 h。
    注:a.  对于细胞或组织切片,孵育需在潮湿环境下进行;
    b.  对于悬浮细胞,孵育需在摇床上进行,或者在孵育的
    过程中,每隔 15 min,轻轻的摇晃一下反应液。
    (4)用含有 0.1% Triton X - 100,5 mg/mL BSA的 PBS 溶
    液清洗样品三次,每次 5 min。
    (5)如果需要,可进行样品复染。采用荧光显微镜或者流
    式细胞仪观察。TUNEL 标记的细胞的细胞核显示出明亮的

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    594-3-dUTP(594-3标记dUTP)