Dye Succinimidyl Ester(SE)（YF®琥珀酰亚-胺酯）产品说明书
Dye Succinimidyl Ester(SE)（YF®琥珀酰亚-胺酯）
产品规格：1 mg
产品货号：XK0035
储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。
产品介绍
SE (or NHS ester)是我司生产的具有氨基反应活性
的一类荧光染料。该类染料的SE基团可以与氨基基团反应
生产稳定的酰胺键。相比于市面上其他同类染料，YF®是稳
定性更强、水溶性更好、荧光强度更优的新一代荧光染料。
我司还提供小批量抗体标记试剂盒Super-n-stain®
Antibody Labeling Kits （S6011） ， 可在30 min内标记5-100 μg
抗体，而无需纯化步骤，简单方便。

使用方法（以标记 IgG 抗体为例）
1. 实验材料
（1）IgG：IgG 不可含有能与染料反应的胺类化学物质，如
氨基酸、Tris、BSA、明胶等。如果 IgG 中含有此类化学物
质，应用 pH~7.4的 PBS缓冲液预先透析处理。叠氮类化
合物的存在不会影响标记反应。
（2）无水 DMSO
（3）NaHCO3
（4）葡聚糖凝胶 G-25透析柱
（5）PBS缓冲液（pH~7.4）
（6）NaN3
（7）BSA
2. 标记方法和步骤
（1）准备标记抗体
用 0.1 M 的NaHCO3溶液（pH~8.3）稀释抗体，使抗体
终浓度为 2.5 mg/mL。如果产品预先用磷酸盐缓冲液稀释，
如 PBS 缓冲液（不含胺基类化合物），那么可以直接在该
缓冲液中加入约 1/10 体积 1M的 NaHCO3母液， 使 NaHCO3
终浓度为 0.1 M。
注：蛋白浓度为2.5 mg/mL 时，标记效率大概为 35%，蛋白
浓度低于 2.5 mg/mL 也可用于标记，但标记效率会降低。当
蛋白浓度高于 5 mg/mL 时，标记效率可能更高。由于缓冲
液和蛋白纯度存在差异性，因而更 的标记效率由实操
条件决定。如果蛋白浓度过低，可以通过超滤法进行浓缩。
（2）准备染料储存液
室温预热一管 1 μmole 的 YF® SE，在管中加入 0.1 mL
的无水 DMSO，充分涡旋溶解染料，配制浓度为 10 mM 的
染料储存液。如果使用更微量的蛋白进行标记反应，那么染
料需要稀释至更低浓度。
注：a. 剩余的染料储存液应于-20℃低温存放，以备后续使
用。如果使用无水 DMSO 配制染料储存液，那么染料至少
可以保存一个月。
b. 染料也可以用去离子水配制，但是由于染料在水中
会缓慢水解，所以水配制的储液 现配现用。
（3）标记反应步骤
a. 搅拌或涡旋混匀蛋白溶液，逐步滴加 15-25 μL 的染料储
存液（10 mM），使染料/蛋白的摩尔比在 9: 1 至15: 1的范
围内。YF® SE 标记 IgG 抗体的 DOL（结合于每个蛋白分子
上的染料数量）范围请参考上表。
b. 在室温下搅拌反应 1 h，微量标记时也可在摇床上振荡孵
育 1 h。
注：在进行结合反应的同时，进行步骤 2(4)，平衡葡聚糖凝
胶 G-25透析柱。
（4）从反应液中分离标记蛋白
a. 用PBS 缓冲液 （pH~7.4） 平衡葡聚糖凝胶G-25透析柱 （10
mm×300 mm）。
b. 将步骤 3(b)反应溶液加入柱子， 并用 1×PBS缓冲液洗脱。
首先洗脱出来的着色带是染料-蛋白结合物。
注：a. 对于小规模的标记反应，为了避免过度稀释产物，
可以使用超滤装置去除结合物中的自由染料。
b. 当结合反应完成后， 如不及时分离染料-蛋白结合物，
可以加入 50 μL 1M 赖氨酸终止反应。多数情况下，不需要
此操作， 因为剩余的未反应的染料在反应 已经被充分水
解。
3. 确定 DOL
（1）蛋白浓度的确定
抗体浓度可通过以下公式计算：
C(mg/mL)={[A280 -(Amax × Cf)]/1.4} × 稀释因子；
a. C是指实验收集的抗体浓度；
b. 稀释因子是指在光度测量时的稀释倍数；
c. A280和 Amax分别是指在 280 nm处的吸光度以及在吸收波
长处的吸光度；
d. Cf是校正因子，YF® SE染料的 Cf值请参考上面表格；
e. 1.4则是指 IgG 的消光系数；
注：过柱洗脱的蛋白溶液直接用于吸光度检测可能浓度过
大，因此需要稀释到大约 0.1 mg/mL。稀释倍数（即稀释因
子）需要从起初抗体数量（比如 5 mg）以及蛋白液洗脱的
总体积来进行预估。
（2）DOL的估算
DOL 通过下式计算：
DOL = (Amax × Mwt × 稀释因子)/(ε × C)
a. Amax，稀释因子，C 值在 3(1)中已经明确；
b. Mwt 是指 IgG 的分子量(150,000)；
c. ε是YF® SE的摩尔吸光系数，参考 页表格；
d. 标记 YF® SE的 IgG 抗体最适DOL 值，请参考 页表
格，DOL 值会波动，但也能得到很好的实验效果。
注意事项
1. 标记的蛋白如需长期储存， 推荐加入 5-10 mg/mL BSA 和
0.01-0.03% NaN3，以防止蛋白变性和微生物滋生。放置于
4℃避光保存。若加入了终浓度为50%的甘油，可放-20℃保
存。可稳定保存一年以上。
2. 操作过程注意避光，搅拌速度应适当以避免产生气泡。
3. 层析柱装柱时，尽量使柱体均匀，柱面平整，无气泡、
裂隙。
4. 上样时注意，当柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品，
洗脱时，当样品走至与凝胶平面相切时再加洗脱液。
5. 影响标记效率的其他因素还包括：温度、反应时间、pH、
荧光染料与蛋白的量等，需注意控制。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。
本产品仅用于科研

Dye Succinimidyl Ester(SE)（YF®琥珀酰亚-胺酯）