总 N-O 检测试剂盒（Total Nitric Oxide Assay Kit）产品说明书
总 N-O 检测试剂盒（Total Nitric Oxide Assay Kit）
产品货号：XK6027S
产品规格：50T, 200T（96孔板）
组分
规格 T6027S（50T） T6027L（200T）
A. 样品稀释液 4 mL 16 mL
B. NADPH 0.5 mg 2 mg
C. FAD 0.5 mL 2×1 mL
D. Nitrate Reductase 250 μL 1 mL
E. LDH Buffer 0.5 mL 2×1 mL
F. LDH 0.5 mL 2×1 mL
G. 1 M NaNO2 250 μL 1 mL
H. Griess Reagent I 2 × 1.25 mL 10 mL
I. Griess Reagent II 2 × 1.25 mL 10 mL
储存条件
-20℃保存，有效期见外包装。NADPH，Nitrate Reductase，
NaNO2，Griess Reagent I 和 Griess Reagent II 需避光保存。
NADPH 配制成溶液后须少量分装，并放于-70℃保存。
产品介绍
NO 作为重要的气体信号分子，广泛存在于生物体内和
各个组织中，并且参与许多生物效应和生理病理过程，NO
带有自由基，这使它的化学性质非常活泼，在体内迅速氧化
生成亚硝酸盐和硝酸盐混合物。 本试剂盒基于 Griess 反应的
原理，采用优化的反应条件，通过硝酸还原酶还原硝酸盐为
亚硝酸盐，从而达到检测总 NO 含量的目的。
本试剂盒可以检测的样品有细胞裂解液、组织裂解液、
细胞或组织的培养液、血清、血浆或尿液等中的一氧化氮含
量。

使用方法
1. 样品处理：
含有高浓度蛋白的样品如血清或者含有高浓度血清的
细胞培养液，在加入 Griess Reagent I 后可能会产生沉淀。
如果产生沉淀，则可将样品沸水浴加热 5 min，以变性蛋白，
然后 12,000 g 离心5 min，取上清用于后续的测定。对于细
胞或组织样品可以用相应的裂解液进行裂解。 对于尿液样品，
通常需要用水稀释 10-50倍后检测。不宜使用肝素抗凝的血
浆，肝素抗凝的血浆会和 Griess Reagent反应产生沉淀。
2. 稀释标准品：
如果样品为血清，则可以简单地使用 PBS、生理盐水等
适当溶液稀释标准品。 其他样品稀释标准品所用的溶液要和
制备或稀释样品时所用溶液保持一致。 稀释的标准品宜现配
现用，不宜冻存。
把 1 M NaNO2稀释成 1 μM、10 μM、20 μM、40 μM、
80 μM、100 μM 六个浓度。
（1）取 1 M NaNO2标准品 1 μL，加到 1 mL 的稀释液中，
得到 1 mM NaNO2溶液。
（2）取1 mM NaNO2溶液 10 μL，加到 90 μL 的稀释液中，
得到 100 μM NaNO2溶液。
（3） 取 100 μM NaNO2溶液 80 μL， 加到 20 μL 的稀释液中，
得到 80 μM NaNO2溶液。
（4）取 80 μM NaNO2溶液，加入等体积稀释液中，得到 40
μM 的 NaNO2溶液。同样方法稀释，得到 10 μM、20 μM
NaNO2溶液。
（5）取 20 μM NaNO2溶液 5 μL，加到 95 μL 的样品所用的
稀释液中，得到 1 μM NaNO2溶液。
3. 试剂的准备
（1）加约 1.2 mL 双蒸水或 Milli-Q级纯水至 2 mg NADPH
中，颠倒混匀溶解后，配制成 2 mM NADPH，放置冰浴上
使用，余下的 NADPH溶液须立即分装后-70℃冻存。
（2）FAD 可以适当分装后-20℃或-70℃保存，使用时放置
在冰浴上使用。
（3）Nitrate Reductase 和 LDH 应放置在冰浴上使用（注意
在使用完毕后立即-20℃保存）。Griess Reagent I 和 Griess
Reagent II在使用前恢复至室温。
4. 参考右侧表格依次加入标准品、样品和检测试剂并进行
相应检测。
5. 根据标准品曲线计算出样品中一氧化氮的浓度。
注意事项
1. 如果 Griess Reagent I 取出时含有沉淀，可将其置于 37℃
水浴锅中，水浴直至沉淀溶解。
2. 对于含有较高浓度硝酸盐的培养液，在检测一氧化氮前
必需先换成其他适当培养液例如 DMEM、MEM、F12等，
或换成 HBSS 或 PBS 等。因为较高浓度的硝酸盐会对本试
剂盒产生干扰。
3. 由于检测过程中有还原反应，凡是影响还原反应的氧化
或还原试剂要注意避免， 例如常用还原剂 DTT 和巯基乙醇。
4. 反应必须避光进行，每次加入试剂时，需避免各检测孔
中产生气泡，以免气泡干扰检测结果。
5. 样品的用量上限为 60 μL，血清、血浆或组织匀浆液通常
使用 40 μL就足够了。样品不足 60 μL 时，不同样品之间的
体积需要保持一致， 体积不足的部分用制备或稀释样品时所
使用的溶液补足。
6. 可以同时设置加入200 μL水或PBS的2-3个孔为阴性对
照， 这 2-3个孔仅仅加入水或 PBS， 不再加入任何其他试剂。
7. 检测时，如无 540 nm滤光片，520-560 nm的滤光片也可
以使用
标准品、样品和检测试剂
空白对照 标准品 样品
标准品 - 60 μL
样品 - - x μL
用于样品稀释的溶液 60 μL - (60-x) μL
NADPH (2mM) 5 μL 5 μL 5 μL
FAD 10 μL 10 μL 10 μL
Nitrate Reductase 5 μL 5 μL 5 μL
混匀后，37℃孵育 30 min
LDH Buffer 10 μL 10 μL 10 μL
LDH 10 μL 10 μL 10 μL
混匀后，37℃孵育 30 min
Griess Reagent I 50 μL 50 μL 50 μL
Griess Reagent II 50 μL 50 μL 50 μL
混匀后，室温（20-30℃）孵育10 min 后，测定540 nm处
吸光度值
本产品仅用于科研

总 N-O 检测试剂盒（Total Nitric Oxide Assay Kit）