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      产品分类
    594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒(红色荧光)
    物品单位 价格 品牌
    213 XKBio
    • 产地:上海
    • 型号:20T
    • 货号:XK6045S
    • 发布日期: 2022-03-24
    • 更新日期: 2022-03-28
    产品详细说明
    产地 上海
    品牌 XKBio
    货号 XK6045S
    用途范围 科研
    纯度 100%
    CAS编号
    规格 20T
    是否进口

    YF®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒(红色荧光)产品说明书
    YF®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒(红色荧光)
    货号 : XK6045S
    产品内容:
    组分 规格 20T 100T 500T 1000T 开封后保存温度 稳定性
    A. 10 mM EdU 40 μL 200 μL 1 mL 2× 1 mL -20℃
    开封后按指-定
    温度保存可有
    效放置一年
    B. YF® 488/555/594/647A Azide 10 μL 50 μL 250 μL 500 μL -20℃,避光
    C. 10× Click-iT EdU 反应缓冲液 200 μL 1 mL 5 mL 10 mL 2-8℃
    D. CuSO4 100 μL 500 μL 2× 1.25 mL 5 mL 2-8℃
    E. Click-iT EdU 缓冲液添加物 6 mg 30 mg 150 mg 2 × 150 mg 2-8℃
    F. Hoechst 33342 5 μL 25 μL 125 μL 250 μL 2-8℃
    规格:上述反应次数针对 96孔板培养的细胞,不同容器的具体用量可参考附表 1。
    荧光光谱数据:YF® 488 Azide:495/519 nm;YF® 555 Azide:555/565 nm;YF®594 Azide:590/617 nm
     647AAzide:650/670 nm;Hoechst 33342:350/461 nm(bound to DNA)
    储存条件
    -20℃避光保存,有效期见外包装。开封后,保存温度详见
    说明书。


    产品介绍
    细胞增殖检测是评估细胞健康程度、 遗传毒性及抗肿瘤
    药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最 的方法是
    BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU
    (5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)是一种嘧啶类似物,在DNA合成
    期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应,一种由铜
    催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应,形成共价键。
    本试剂盒中,EdU含有炔烃,YF® 488/555/594/647A
    Azide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有
    效,易于使用。BrdU方法需要DNA变性(如酸变性、热变
    性或者用DNase消化)暴露出BrdU,从而方便BrdU抗体结
    合;而EdU法只需标准化的多聚甲醛固定和Triton X-100促
    渗就可以使检测试剂进入细胞, 只需少量的叠氮化染料即可
    非常有效地标记出整合的EdU。
    本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分,可以用于
    体外培养细胞的增殖检测。
    使用方法
    实验材料(自备)
    ? 10 mM PBS, pH 7.2-7.6
    ? 4 %多聚甲醛固定液(in PBS)
    ? 促渗试剂(0.5 %Triton X-100 in PBS)
    ? 2 mg/mL 甘氨酸溶液(in ddH2O)
    ? 3 %BSA in PBS, pH 7.2-7.6
    ? 1 % BSA in PBS, pH 7.4
    ? ddH2O
    荧光显微镜检测方法
    1. 细胞培养
    取对数生长期细胞,以每孔4×103
    -1×105
    细胞(可根据细胞
    大小、 生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密
    度)接种于96孔板中,培养至正常生长阶段。
    2. 药物处理
    客户可以根据实验需要进行各种药物处理。
    3. EdU标记
    (1) 用细胞完全培养基按一定比例稀释EdU溶液 (组分A) ,
    制备适量EdU培养基;
    注:EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整,建议以 10
    μM的初始浓度进行摸索。预实验中,建议设置 EdU浓度梯
    度,可参考附表 2和附表 3。
    (2)细胞培养箱中孵育一段时间。
    注:EdU浓度与孵育时间相关,短时间孵育(<2 h)宜采用
    高浓度,如:10~50 μM;长时间孵育(>24 h)宜采用低浓
    度,如:1~10 μM;也可参考附表 3。
    4. 细胞固定及促渗
    (1)孵育完成后,去除培养基。加入50 μL 4 % 多聚甲醛
    固定液,室温孵育15-30 min后,去除固定液。
    (2)每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液,室温孵育5 min,
    中和残留的固定液。
    (3)以每孔100 μL 3 % BSA洗涤细胞2次。
    (4)去除洗涤液,加入100 μL 0.5 % Triton X-100,室温孵
    育20 min。
    (5) 去除促渗剂, 每孔100 μL的 3% BSA 洗涤液洗涤 2次。
    5. EdU检测
    注:本参考步骤每个样本使用100 μL的工作液,用户可以根
    据自己的样本情况调整用量。
    (1)配置1× Click-iT EdU反应缓冲液(组分C):用ddH2O
    将组分C稀释10倍。
    (2)配置5× Click-iT EdU缓冲液添加物 (组分E) : 加300 μL
    的ddH2O至30 mg的E组分管中(终浓度100 mg/mL),混匀
    至全部溶解。使用后,剩余储液存放在-20℃,可保存一年,
    溶液一旦呈现棕色,则说明有效成分降解不能再用。
    注:不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解,制备成
    5× 储液备用。
    (3)准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物:用ddH2O稀释5×
    Click-iT EdU缓冲液添加物至1×,溶液应现配现用。
    (4)依据表 1准备 Click-iT工作液。
    表 1: Click-iT 工作液
    反应组分 以 10个孔的
    样本数为例
    1× Click-iT EdU 反应缓冲液 855 μL
    CuSO4 (组分 D) 40 μL
    YF® 488/555/594/647AAzide(组分 B) 5 μL
    1× Click-iT EdU缓冲液添加物 100 μL
    总体积 1 mL
    (5)每孔加入 100 μL Click-iT工作液,均匀覆盖细胞。
    (6)室温避光孵育 30 min。
    (7)除去 Click-iT 工作液,以 100 μL 3% BSA 洗涤细胞 2
    次后, 去除洗涤液。 如其他无特别要求, 即可进行拍照分析。
    6. DNA 复染(可选)
    (1)用 100 μL PBS洗涤细胞1 次,去除洗涤液。
    (2)用 PBS将 Hoechst 33342(组分F)稀释 2000倍。
    (3)每孔加 100 μL 1× Hoechst 33342溶液,室温避光孵育
    15-30 min。
    (4)去除 Hoechst 33342 溶液,用 100 μL PBS 洗涤细胞 2
    次。
    7. 成像及分析
    流式细胞仪检测方法
    1. 细胞培养
    取对数生长期细胞,以每孔4×103
    -1×105
    细胞(可根据细胞
    大小、 生长速度以及实验处理的具体要求调整细胞数量和密
    度)接种于 96孔板中,培养至正常生长阶段。
    2. 药物处理
    客户可以根据实验需要进行各种药物处理。
    3. EdU 标记细胞
    (1)培养基稀释 10 mM EdU至合适浓度, 阴性对照组不用
    EdU处理。
    注:EdU 的标记浓度需根据细胞类型加以调整,建议以 10
    μM 的初始浓度进行摸索。预实验中,建议设置 EdU 浓度梯
    度,可参考附表 2和附表 3。
    (2)细胞培养箱中孵育一段时间。EdU孵育细胞的时间可
    以直接用作测定细胞 DNA 合成的指标,时间点选择以及孵
    育的时间取决于细胞生长速率。通过短暂的 EdU 孵育进行
    的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。
    注:EdU浓度与孵育时间相关,短时间孵育(<2 h)宜采用
    高浓度,如:10~50 μM;长时间孵育(>24 h)宜采用低浓
    度,如:1~10 μM;也可参考附表 3。
    4. 细胞固定及促渗
    注:对于需要做细胞表面抗原标记的实验,可以考虑在完成
    EdU 孵育后,以含 1 % BSA 洗涤细胞 2 次,在细胞固定促
    渗之前进行。
    (1)孵育完成后,收集细胞,1 % BSA清洗细胞1次,离心
    收集细胞。
    (2)100 μL 4 % 多聚甲醛重悬细胞。
    (3)室温避光孵育 15 min。
    (4)1 % BSA 洗涤细胞 2次。
    (5)100 μL 0.5 % Triton X-100促渗液重悬细胞,室温孵育
    20 min。
    5. EdU 检测
    注:针对96孔板样本可参考每孔100 μL 的工作液来进行,
    用户可以根据自己的样本情况调整用量。
    (3)配置1× Click-iT EdU反应缓冲液:用ddH2O将组分C稀
    释10倍。
    (4)配置 5× Click-iT EdU缓冲液添加物 (组分 E) : 加 300
    μL ddH2O 至 30 mg 的组分 E试管中(终浓度 100 mg/mL),
    混匀至全部溶解。使用后,剩余储液存放在-20℃,可保存
    一年,溶液一旦呈现棕色,则说明有效成分降解不能再用。
    注: 不同规格的组分E均按照此比例加ddH2O溶解为5× 储
    液备用。
    (3)准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物:以ddH2O稀释5×
    Click-iT EdU缓冲液添加物储液至1×,溶液应现配现用。
    (4)依据表 2准备 Click-iT工作液。
    反应组分 单次反应所需
    加液体积
    1× Click-iT EdU 反应缓冲液 875 μL
    CuSO4 (组分 D) 20 μL
    YF® 488/555/594/647A Azide(组分
    B)
    5 μL
    1× Click-iT EdU 缓冲液添加物 100 μL
    总体积 1 mL
    (5)每管加入 1 mL Click-iT 工作液,混匀。
    (6)室温避光孵育 30 min。
    (7)1% BSA洗涤细胞 1 次,收集细胞,用 1 mL 1 % BSA
    再次重悬细胞 (重悬细胞的溶液体积可根据细胞的数量加以
    调整),流式细胞仪检测。
    注:如需进行其他标志物检测可参考步骤4。
    6. 细胞内抗原标记(可选步骤)
    (1)加入抗体工作液,混匀。
    (2)避光条件下,以合适的温度及时间孵育抗体。
    7. DNA 含量计算(可选步骤)
    (1)如有需要,可加入适量 RNase 至每管,混匀。
    (2)每管加入适量 DNA 染色液,避光孵育 10-15 min。
    (3)上机待检。
    附录:
    附表 1.EdU 培养基及染色反应液的参考使用量
    96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm小皿
    EdU培养基 100 μL 150 μL 200 μL 500 μL 1 mL 2 mL
    染色反应液 100 μL 150 μL 200 μL 500 μL 1 mL 2 mL
    附表 2. EdU 的参考孵育时间
    细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 鼠成纤维细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞系 人神经细胞
    细胞周期 ~30 min ~3 h ~18 h ~21 h ~25 h ~5 d
    孵育时间 5 min 20 min 2 h 2 h 2 h 1 d
    注:(1)EdU孵育时间取决于细胞周期,一般为细胞周期的 1/10至1/5,但大多数细胞系均可采用 2 h孵育时间;
    (2)考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响,细胞周期会有所变化。
    附表 3. 文献中EdU 孵育浓度及时间
    PubMed ID Reference Cell Line Concentration Time
    18272492 Salic A,et al.PNAS.2008 NIH3T3,Hela 10 nM~10 μM 1 h
    18521918 Cappella P, et al. Cytometry A.2008 HL-60,A2780,U2OS 1~10 μM 0.5 h
    18996411 Chehehasa F, et al.Neurosci Methods.2009 Neurospheres 1~20 μM 24 h
    19179371 Limsirichaikul S, et al.Nucleic Acids Res.2009 Primary fibroblasts 10 μM 1,2,4 h
    19253396 Warren M, et al. Dev Dyn.2009 Chick embryos 10 μM~2 mM 4 h
    19647746 Yu Y, et al. J Immunol Methods.2009 Spleen cells 50 μM 24 h
    19544417 Momcilovic O, et al.Stem Cells.2009 Human ES cells 10 μM 0.5 h
    20080700 Cinquin O, et al. PNAS.2010 emb-30 1 μM 12 h
    20025889 HanW, et al. Life Sci.2009 VSMC 50 μM 2 h
    20659708 Huang C, et al. J Genet Genomics.2010 ESC 50 μM 2 h
    21310713 Hua H, et al. Nucleic Acids Res.2011 Fission yeaststrains 10 μM 3 h
    20824490 Lv L, et al.Mol Cell Biochem.2011 EJ cells 50 μM 4 h
    21248284 Yang S, et al.Biol Reprod.2011 GC cells 50 μM 2 h
    21227924 Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res.2011 U2OS, HT29 30 μM 1.5 h
    21829621 Guo T, et al.PloS One. 2011 HIT-T15 50 μM 4 h
    21980430 Zeng T, et al.PloS One. 2011 MCF-10A 25 μM 2 h
    22012572 Ding D, et al.Int Orthop.2011 C3H10T1/2 10 μM 24 h
    22000787 ZengW, et al. Biomaterials.2011 EPC 50 μM 4 h
    21913215 Xue Z, et al. J Cell Biochem.2011 SGC7901 25 μM 24 h
    22016038 Peng F, et al.Lasera Med Sci.2011 MSC 50 μM 2 h
    21878637 Li D, et al. J Biol Chem.2011 HCC 50 μM 2 h
    本产品仅用于科研

    594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒(红色荧光)