上海晅科生物科技有限公司
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      产品分类
    Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒
    物品单位 价格 品牌
    1106 XKBio
    • 产地:上海
    • 型号:20T
    • 货号:XK6068S
    • 发布日期: 2022-03-24
    • 更新日期: 2022-03-24
    产品详细说明
    产地 上海
    品牌 XKBio
    货号 XK6068S
    用途范围 科研
    纯度 100%
    CAS编号
    规格 20T
    是否进口
    Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒产品说明书
    Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒
    产品货号:XK6068S
    产品规格:20T, 50T
    产品内容:
    组分
    规格 XK6068S(20T)XK6068S(50T)
    A. Biotin TUNEL Reaction Buffer 1 mL 2 × 1.25 mL
    B. TdT酶 20 μL 50 μL
    C. Streptavidin-HRP 20 μL 50 μL
    D. Streptavidin-HRP稀释液 1 mL 2×1.25 mL
    E. DAB显色液A 100 μL 250 μL
    F. DAB显色液B 1 mL 2×1.25 mL
    G. DAB显色液C 50 μL 125 μL
    H. Proteinase K (2 mg/mL) 40 μL 100 μL
    I. DNase I (2 U/μL) 5 μL 13 μL
    J. 10 × DNase I Buffer 100 μL 260 μL
    储存条件
    本产品应置于-20℃储存,组分 A、E、G 需避光,避
    免反复冻融。有效期见外包装。注:组分 A、E、F、G 使
    用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。
    产品介绍
    细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,
    这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片
    段约为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中
    呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,
    应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl
    Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3′-OH 末端催化
    掺入生物素(Biotin)标记的 dUTP (Biotin-X-dUTP)。随后
    和 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 标 记 的 Streptavidin
    (Streptavidin-HRP)特异结合, 在 HRP 的催化下通过
    DAB 显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜
    观察并计数凋亡细胞。 由于正常的或正在增值的细胞几乎没
    有 DNA 的断裂,因而没有 3′-OH 形成,很少能被染色。
    TUNEL 法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测,而
    非坏死细胞或因辐照和药物 而造成的DNA链断裂的细

    胞,是一种更快速、直接的检测手段。

    使用方法
    实验材料(自备)
    ? PBS缓冲液(pH~7.4)
    ? 4%多聚甲醛(PBS配制)
    ? PBS配制 0.3% H2O2(新鲜配制)
    ? 70%乙醇(自选)
    ? 脱蜡溶剂(石蜡切片样本)2 / 3
    US EVERBRIGHT
    生物荧光试剂

    本产品仅用于科研
    实验步骤
    1. 样本准备:
    (1)细胞样品
    a. 可选: 准备一份阴性对照样本 (加入不含TdT酶的TUNEL
    反应液)。
    b. PBS 清洗细胞两次。
    c. 细胞固定:加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃放
    置 30 min。
    d. PBS 清洗细胞两次。
    e. 通透细胞:细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100
    溶液通透,室温放置 20 min。
    f. PBS清洗细胞两次。
    g. 封闭细胞: 每孔加入100 μL左右的配制于PBS中的0.3 %
    H2O2溶液,轻敲孔板使其充分覆盖细胞,室温避光封闭 30
    min,用 1×PBS 清洗细胞2 次;
    (2)石蜡组织切片
    a. 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2次, 每次 5 min,以
    脱掉石蜡。
    注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。
    b. 室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2次,每次 5
    min。
    c. 室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇
    (95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每
    次 5 min。
    d. 室温下,将切片浸没于纯水中漂洗 3 min,再将切片浸没
    于1×PBS中漂洗3 min, 用滤纸小心吸干切片样本周围液体。
    e. 用免疫组化笔围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。
    f. 按1: 100的比例, 将 2 mg/mL的蛋白酶 K 溶液用1 × PBS
    稀释至终浓度 20 μg/mL,在每个样本上滴加 100 μL,使溶
    液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min(蛋白酶 K 的孵育
    时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
    注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,时间短达不到通透效果,
    但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下, 厚度 4 μm
    孵育 10 min,厚度30 μm孵育 30 min。
    g. PBS 浸润清洗切片两次,每次5 min。
    h. 封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜
    配制),室温孵育 30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。
    i. PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的
    液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
    (3)冰冻组织切片
    a. 将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20 min,晾干。
    b. 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液中,室温固定 30 min。
    c. PBS浸润清洗切片两次,每次 5 min。
    d. 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
    e. 按1:100的比例,将 2 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液用 1× PBS
    稀释至终浓度 20 μg/mL。每个样本上滴加 100 μL,使溶液
    覆盖全部样本区域,室温孵育 10 min(Proteinase K 的孵育
    时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
    注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,时间短达不到通透效果,
    但延长孵育时间可能导致切片脱落。 一般情况下, 厚度 4 μm
    孵育 10 min,厚度 30 μm孵育 30 min。
    f. PBS 浸润清洗切片两次,每次5 min。
    g. 封闭:加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液(新鲜
    配制),室温孵育 30 min,以灭活切片内源的过氧化氢酶。
    h. PBS清洗样品 3次,每次 5min,用滤纸吸去多余的液体,
    将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
    (4)阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进
    行 TUNEL反应步骤)
    a. 按 1:10 的比例用 diH2O 将 10× DNase I Buffer 稀释成 1 ×
    DNase I Buffer 备用。
    b. 滴加 100 μL 1× DNase I Buffer 到已通透的样本上,室温
    平衡 5 min。
    c. 用 1× DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL),使
    其为终浓度 20 U/mL的工作液。
    d. 轻轻吸掉多余液体, 加入 100 μL浓度为 20 U/mL DNase I
    工作液,室温孵育 10 min。
    e. 轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2次。
    2. TUNEL 反应
    (1)配制TUNEL 反应液(即用即配):3 / 3
    US EVERBRIGHT
    生物荧光试剂

    本产品仅用于科研
    1 个
    样品
    5个
    样品
    10个
    样品
    TdT酶 1 μL 5 μL 10 μL
    Biotin TUNEL
    Reaction Buffer
    49 μL 245 μL 490 μL
    TUNEL 反应
    液总体积
    50 μL 250 μL 500 μL
    (2)每个样品加入 50 μL TUNEL 反应液,37℃避光孵育
    60 min,组织样本需要 2 h(阴性对照样品加入不含 TdT酶
    的 TUNEL反应液)。
    注:50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96孔
    板、48孔板、24孔板或 12孔板的一个孔,如果是 6孔板,
    建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发,建
    议在样品上覆上防蒸发膜。
    (3)PBS清洗反应后的样品 3次,每次 5 min。
    3. Streptavidin-HRP 工作液和 DAB 显色液的配制
    (1)Streptavidin-HRP工作液的配制(即用即配):
    1个
    样品
    5个
    样品
    10个
    样品
    Streptavidin-HRP 1 μL 5 μL 10 μL
    Streptavidin-HRP
    稀释液
    49 μL 245 μL 490 μL
    Streptavidin-HRP
    工作液总体积
    50 μL 250 μL 500 μL
    (2)DAB 显色液的配制(即用即配):
    1 个样品 5个样品 10个样品
    DAB显色液A 5 μL 25 μL 50 μL
    DAB显色液B 42.5 μL 212.5 μL 425 μL
    DAB显色液C 2.5 μL 12.5 μL 25 μL
    DAB 显色液总体积 50 μL 250 μL 500 μL
    Biotin TUNEL细胞凋亡试剂盒