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细胞复苏、传代与冻存的基本操作流程

发表时间：2021-06-22

细胞复苏、传代与冻存操作流程

一、仪器与试剂

仪器	试剂	耗材
离心机	胎牛血清（FBS）	离心管（15ml、50ml）
生物安全柜	无菌 1×PBS pH=7.2	T-25 细胞培养瓶
电动移液器	0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA	一次性无菌移液管（2ml、5ml、10ml）
CO₂ 培养箱	完全培养基（含血清）	1.8mL 冻存管
倒置显微镜液氮罐	冻存液：90%FBS+10%DMSO 异丙醇	程序降温盒
恒温水浴锅
超低温冰箱

护目镜、厚毛线手套等

二、操作流程：
复苏

将恒温水浴锅中的水预热到 37℃；
准备一支 15ml 离心管，加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基，放入 37℃水浴锅中预热；
戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；
将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm 离心 5min；
准备一个 T-25 培养瓶，写上细胞名称、日期，再加入 4ml 完全培养基；
离心完成后弃去上清，用 1ml 完全培养基重悬细胞后，转入 T-25 细胞培养中，混匀后转入CO₂ 培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留
的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入 37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气
化而爆炸。

传代 （细胞传代建议一传二）

当细胞汇合度达到 85%以上时，可进行传代。
在生物安全柜内，打开培养瓶瓶口，收集瓶内的培养基；
向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后，水平放置培养瓶，使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积，吸弃 PBS；
向瓶内加入消化液 1ml，浸润底面后放入 37℃ CO₂ 培养箱中孵育 1~2min；
孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml 含 10%FBS 的完全培养基中，将悬液吸入 15ml 离心管，

注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：
① 准备一个无菌的 15ml 离心管，加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基；
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和（避免吹打）；
③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右，轻拍培养瓶，95%左右细胞脱
落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内

1000rpm 离心 5min；
准备两个新的 T-25 培养瓶，各加入 4ml 完全培养基。
离心完成后，弃上清，用 2ml 完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶，每个培养瓶各 1ml；
水平放置培养瓶，震荡混匀后，将培养瓶置于 37℃，5%CO₂ 培养箱中静置培养。

冻存（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）

1）~6）参照传代步骤

离心完成后，弃上清，用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀，然后转入 1.8ml 冻存管中；
将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；
第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

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细胞复苏、传代与冻存的基本操作流程

冻存 （细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）

冻存（细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支）